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Como escolher a fase móvel em análises HPLC

A cromatografia líquida de alta eficiência é um método de separação de compostos químicos presentes em uma solução.

 

Basicamente ela consiste no bombeamento de um ou mais líquidos (fase móvel) que transportam a amostra através de uma coluna cromatográfica contendo material sorvente (fase estacionária). 

 

Os compostos presentes na amostra chegarão ao detector em diferentes tempos dependendo das interações entre a fase estacionária, as moléculas analisadas e o solvente ou solventes utilizados. 

 

Essas interações são principalmente devido às diferenças de polaridade das substâncias. Logo, como cada componente da amostra interage de maneira distinta, acaba afetando diretamente a velocidade que os compostos atravessam a coluna e chegam ao detector. 

 

Informações gerais para a correta disposição e escolha das fases móveis

 

Abaixo, trataremos sobre algumas características importantes que devem ser levadas em consideração para a correta escolha e disposição da fase móvel no equipamento HPLC.

 

Como devem ser os reservatórios das fases móveis?

 

  • O frasco deve ser de vidro (borossilicato) ou dependendo da fase móvel empregada, poderá ser de teflon ou outro polímero adequado; 

  • A tampa deve conter furos para a passagem das tubulações (canais) de passagem da fase móvel (linha de solvente);

  • A linha de solvente deve apresentar um filtro para reter eventuais partículas sólidas presentes no solvente. 

Quais as características ideais para as fases móveis?

 

  • Ser de alto grau de pureza (Aqui na SC Química você encontra as melhores marcas);

  • Solubilizar a amostra sem degradar os seus componentes; 

  • Não decompor ou dissolver a fase estacionária;

  • Apresentar baixa viscosidade; 

  • Ser compatível com o detector utilizado; 

  • Ter polaridade adequada para permitir uma separação dos componentes da amostra. 

Como escolher os solventes com base na polaridade?

 

Como vimos anteriormente, a polaridade é um dos principais fatores que influenciam o processo de separação. Assim, quanto maior a interação solvente-soluto, menor a retenção.

 

Para avaliar a força eluente, que pode ser entendida como uma medida da adsorção do solvente (fase móvel), considerando como referência o valor da interação do pentano, utiliza-se a chamada Série eluotrópica (listagem de diversas substâncias ordenadas segundo seu poder de eluição para um determinado adsorvente). 

 

Na tabela a seguir, apresentamos a série eluotrópica para solventes em cromatografia de adsorção em sílica.

 

Solvente

Força de Eluição

Pentano 

0,00

Heptano

0,01

Hexano

0,01

Triclorotrifluoretano

0,02

Tolueno

0,22

Clorofórmio

0,26

Diclorometano

0,30

Dieteiléter

0,43

Etilacetato

0,48

Metil-t-butil-éter

0,48

Dioxano

0,51

Acetonitrila

0,52

Acetona

0,53

Tetrahidrofurano

0,53

2-Propanol

0,60

Metanol

0,70

 

Assim, pode-se dizer que quanto maior a força do eluente, mais rápida será a eluição do soluto através da coluna. 

 

Frequentemente, são empregados gradientes de eluição nas separações cromatográficas,  com o objetivo de alterar a força do eluente ( alterando a porcentagem da composição da fase móvel)  otimizando a análise  e a separação dos compostos.

 

 

LANÇAS, Fernando M. Cromatografia líquida moderna: HPLC/CLAE. Campinas: Editora Átomo, 2009.

 

COLLINS, Carol H.; BRAGA, Gilberto L.; BONATO, Pierina S. Fundamentos de cromatografia. In: Fundamentos de cromatografia. 2006. p. 453-453.