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Passo a passo para a correta seleção da fase estacionária de colunas HPLC.

 

Um dos primeiros desafios enfrentados pelos analistas que utilizam técnicas cromatográficas é a escolha correta da coluna que será utilizada para a análise. 
 
São diversos fatores que influenciam nessa etapa. Para um analista, é fundamental que a coluna seja capaz de separar os compostos em questão de maneira inequívoca, mas existem diversos outros pontos que devem ser ponderados.
 
A separação cromatográfica é baseada principalmente nas interações entre:
 
• os analitos componentes da mistura
• fase estacionária e
• fase móvel.
 
Como escolher a melhor coluna HPLC para minha análise ?
 
As características de uma coluna devem ser escolhidas de acordo com o objetivo da análise e das metas do método de separação. Certamente, quanto maior o conhecimento sobre a composição das amostras que serão analisadas, melhor será o refinamento e a escolha da coluna adequada. 
 
Outro ponto importante é o conhecimento do equipamento que será utilizado. É fundamental conhecer suas características e limitações.  
 
Como escolher a fase estacionária?
 
1- Faça o desenho de todas as estruturas moleculares dos analitos presentes na amostra, agrupe as estruturas similares e sinalize as diferenças. 
 
2- Utilize os resultados para escolher a fase estacionária capaz de discriminar os analitos com base em seus grupos funcionais e polaridades. A escolha da fase estacionária (material presente nas colunas cromatográficas) estará diretamente relacionada a essas características.
 
a. FASE NORMAL é o nome dado quando a composição da fase estacionária é polar. Nessa composição são utilizadas fases móveis apolares e as substâncias apolares que apresentam menor interação com a fase estacionária serão as primeiras a eluir. São indicadas para a análise de substâncias insolúveis em água, como lipídios, gorduras e óleos. 
 
b. FASE REVERSA é o nome dado quando a composição da fase estacionária é de baixa polaridade. Nessa composição as fases móveis mais utilizadas são:
• Água
• Acetonitrila e
• Metanol
Já as substâncias polares que apresentam menor interação com a fase estacionária serão as primeiras a eluir. 
 
3- Após eleita a fase estacionária de acordo com sua polaridade (normal ou reversa), deve-se avaliar qual, dentre as opções de fases normais ou reversas, é a mais indicada.
 
• C18, C8, C4 e C2: São fases estacionárias com baixa polaridade. Podem ser utilizadas para a separação de fármacos com baixa polaridade, peptídeos, proteínas, esteróides, hidrocarbonetos aromáticos, vitaminas solúveis entre outros.
• Fenil: Também apresenta baixa polaridade e é indicada para a separação de substâncias moderadamente polares. 
• Ciano ou nitrila: Apresentam polaridade intermediária e podem ser utilizadas em modo normal ou reverso.  Essas fases são indicadas ​​para análises de compostos orgânicos polares. 
• Amina: Essa fase estacionária polar pode ser utilizada para análises de pesticidas e ésteres por exemplo.  
 
É muito importante que após a escolha da fase estacionária, o analista/pesquisador entre em contato com o fornecedor e discuta a indicação de utilização. O correto aconselhamento é fundamental para a escolha correta da coluna cromatográfica e consequentemente para o desenvolvimento do método cromatográfico. 
 
 
Fonte: 
An Efficient Approach to Column Selection in HPLC Method Development by Craig S. Young and Raymond J. Weigand, Alltech Associates, Inc. 2051 Waukegan Road • Deerfield, IL 60015 - acesso em Set 2020
 
https://www.chromatographyonline.com/view/hplc-column-selection - acesso em Set 2020